下面是小编为大家整理的柱色谱法实验报告（精选文档）,供大家参考。
柱色谱法实验报告 一、【实验目的】 1．了解柱层析的分类，掌握各种柱层析的原理。
2．熟练掌握吸附层析的原理和操作技术。
二、【实验原理】 叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素 a、叶绿素 b、胡萝卜素和叶黄素组成。从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用 95%乙醇或无水乙醇提取。
分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。柱层析法是色谱法中的一种，它是根据混合物中各组分对固定相的吸附能力，以及对洗脱剂（即移动相）的溶解度不同将各组分分离。常用的柱色谱有吸附色柱谱和分配柱色谱两类。
吸附柱色谱通常是在玻璃管中填入表面积很大，经过活化的多孔性物质或粉状固体作为吸附剂（如氧化铝或硅胶），当混合物的溶液流经吸附柱时，就被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入溶剂（洗脱剂）洗脱。由于不同化合物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶剂中的溶解度也不同，因此各组分随溶剂以不同速度下移，形成色带。继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分就随溶剂首先流出，整个层析过 程进行反复的吸附-解析-再吸附-再解吸。用柱层析法可以分别收集各组分，并逐个鉴定。
本实验是把三氧化二铝填入玻璃管中（压成柱状）作为吸附剂，将叶绿体色素的石油醚提取液倾于吸附柱上，色素即被吸附。由于色素的种类不同，被吸附的强弱不同，就在吸附柱上排列成为不同的色层，再利用吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力，用不同的溶剂进行洗脱，从而达到叶绿体主要的 4 种色素（叶绿素 a、叶绿素 b、叶黄素、胡萝卜素）的分离。
三、【实验材料】 原料：
新鲜的菠菜叶 试剂 ：
1． 无水乙醇或 95%乙醇 5.三氧化二铝 2． 石英砂 6．饱和氯化钠溶液 3． 丙酮 7.水硫酸钠 4． 石油醚（60-90℃） 8 洗脱液：丙酮：石油醚＝1：9 器材 ：
层析柱（1×30cm）， 研钵， 蒸馏装置， 脱脂棉， 天平， 烧杯， 过滤漏斗， 玻璃棒， 锥形瓶， 分液漏斗， 试管 ， 铁架台 四、【实验操作】 1． 色素的提取：
20 克菠菜，加少许石英砂，再加 20 毫升无水乙醇研磨成浆，脱脂棉过滤，保存滤液，滤渣再用无水乙醇提取一次，合并滤液，滤渣再加入 30 毫升石油醚提取一次，过滤，合并滤液，转移至分液漏斗中,再加入 40 毫升饱和氯化钠溶液震荡，弃去下层溶液，再分别加入 20 毫升水震荡洗涤几次，直至下层无色，保留上层溶液，转移至三角瓶中，加入无水硫酸钠干燥 5 分钟，备用. 2．样品的浓缩：
将提取液放入蒸馏烧瓶中，蒸除多余的石油醚，至剩余液体 5-8毫 升左右，以备加样使用。
3．层析拄的制备：
15 克碱性三氧化二铝加入 30 毫升石油醚搅拌，浸泡 10min.。在层 析拄内加入一团棉花在底部，再加入石英砂 0.5cm 以上，然后用石油醚半充满柱子，再将浸泡好的三氧化二铝倒入柱内，倒时应该缓慢，重复使用下面的石油醚，直到装完。用石油醚洗柱内壁，顶部加一小团棉花，然后再填入石英砂 0.5 厘米高。
3．样品的分离层析：吸附层析分离色素 打开层析拄下部开关，向拄内加入 2 毫升浓缩液，至液体没入砂内， 再加入石油醚冲洗拄壁，液体浸入砂内，加洗脱液开始层析，可以看到不同色带如图片 1，直至第一条色带洗脱完毕，在拄下面用试管接收第一条色带的洗脱液，如图片 2。
五、【实验结果】 实验结果如下图：
图一：层析柱中出现黄色带 图二：提取出的黄色胡萝卜素 结果分析：
洗脱过程中，首先有一条黄色的色带圈沿着层析柱下移，色带圈的各个方向的移动速度并不是完全相同，原因在于层析柱的制作 过程并不完全均一，使层析柱内部不均匀，以至于色带各方向的移动速度不同。最后收集得到亮黄色的胡萝卜素。
七、【注意事项】 1、萃取时不要剧烈振荡，以防止发生乳化现象。
2、为了保持柱子的均一性，使整个吸附剂浸泡在溶剂或溶液中是必要的，否则当柱中溶剂或溶液流干时，就会使柱身干裂，影响渗透和显色的均一性。因此要保证整个装样过程中溶剂要高于三氧化二铝的表面。
3、在吸附剂上端加入脱脂棉（或滤纸）是使加样品时不致把吸附剂冲起；在吸附柱下端加脱脂棉（或沙子）可以防止吸附剂细粒流出。
4、层析柱填装紧密与否，对分离效果很有影响，若各部分松紧不匀，会影响渗透速度和显色的均匀。
6、洗脱流速不宜过快，避免因此压紧凝胶，色素分离不开；也不要过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降，色素洗脱很慢。因此应控制洗脱流速，以每分钟 60~80 滴为宜。
7、样品一定要足够浓缩，加样量不要过大，过大，分离条带过宽，如果层析拄不够长，各组分不易分开，易同时洗脱下来；加样量过少，色带不是很清楚，不易观察，效果不好。
8、层析柱粗细必须均匀，柱管大小可根据试剂需要选择。一般来说，细长的柱分离效果较好。若样品量多，最好选用内径较粗的柱，但此时分离效果稍差。柱管内径太小时，会发生"管壁效应"，即柱管中心部分的组份移动慢，而管壁周围的移动快。柱越长，分离效果越好，但柱过长，实验时间长，样品稀释度大，分离效果反而不好。
八、【实验小结】 在该柱层析分离色素实验中，我了解了柱层析技术的相应方法和原理，学会了层析柱的制作和准备，进一步了解绿叶中色素的组成及各色素的颜色和性质、洗脱液的配比、层析柱的制作及洗脱液的流速是本实验成功与否的三大关键因素。
知识拓展：
1、溶剂的选择：
（1）吸附剂要求较纯，否则会影响样品的吸附和洗脱。
（2）溶剂和吸附剂不能起化学反应。
（3）溶剂的极性应比样品小，如果大了，样品不宜被吸附剂吸附。
（4）溶剂对样品的溶解度不能太大，否则影响吸附，但也不能太小，溶液的体 积增加，易使色谱分散。
（5）可使用混合溶剂，如有的组分含有较多的极性基团，在极性小的溶剂中溶 解度太小。也可选用极性大的溶剂溶解，然后加入一定量的非极性溶剂。这样既降低了极性，又减少了溶液的体积。
2、洗脱剂的选择：
样品吸附在氧化铝柱上后，用合适的溶剂进行洗脱，这种溶剂称为洗脱剂。如果原来用于溶解样品的溶剂冲洗柱不能达到分离的目的，可以改用其他溶剂，一般极性较强的溶剂影响样品和氧化铝之间的吸附，容易将样品洗脱下来，达不到分离的目的。
因此常用一系列极性渐次增强的溶剂，既先使用极性最弱的溶剂，然后加入不同比例的极性溶剂配成洗脱溶剂。常用的洗脱溶剂的极性按如下次序递增。
己烷和石油醚＜环己烷＜四氯化碳＜三氯乙烯＜二硫化碳＜甲苯＜二氯甲烷＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜丙醇＜乙醇＜甲醇＜水＜吡啶＜乙酸。篇二：实验六：薄层层析与柱层析 实验六 薄层层析与柱层析 实验目的 1. 了解偶氮苯的光学异构反应，加深对光化学反应的理解。
2. 掌握薄层层析的基本操作,薄层层析分离顺、反式偶氮苯。
3. 了解柱层析分离有机化合物的原理，初步掌握层析柱装填和洗脱的操作方法 4. 采用柱层析分离反式偶氮苯与靛红的混合物 实验原理 偶氮苯是最简单的芳香偶氮化合物，众多偶氮染料的母体结构。含有两个苯基分别与偶氮基-n=n-两端相连的结构。偶氮苯有毒，易燃。偶氮苯有顺（z）-反（e）-异构体。反式为橙红色棱形晶体，蒸气为深红色，溶于乙醇、乙醚、醋酸和水。反式的热力学性质稳定。当溶于乙醇的偶氮苯用一定强度的紫外光照射时，顺式的比例逐渐增大，直至达到平衡，形成顺反异构体的混合物。偶氮苯的光致异构是很多偶氮类功能材料光响应的基础。顺式为橙红色片状晶体，不稳定，在加热或可见光照射下能够变成反式。
色谱方法是通过在固定相和流动相间分配的不同而将物质分离开。待分离混合物各组分在固定相上的吸附强度不同，与流动相一起移动的速度也不同，因此被分离开。
薄层色谱属于固-液吸附色谱。薄层色谱板中的固定相中的微孔结构使得溶剂在毛细管作用下能够沿着色谱板向上移动。由于混合物中各组分对吸附剂（固定相）的吸附能力不同，当展开剂（流动相）流经吸附剂时发生无数次吸附解附过程，吸附力弱的组分随流动相迅速向前移动，吸附力强的组分滞留在后，由于 各组分具有不同的移动速度，最终在固定相薄层析上分离。tlc除了用于分离外，还可以通过与已知结构的的化合物比对，鉴定少量有机混合物的组成，它也是柱色谱寻求最佳展开剂的手段。上图中红色化合物的 rf 等于竖直红线的长度除以竖直蓝线的长度。
柱层析也属于固-液吸附色谱。在一根玻璃"分离柱"中进行。管中装上适当的粉末作为国定相。待分离或纯化物质的溶液（流动相）在重力作用下流经吸附剂时，不同物质对溶剂和吸附剂的亲和力不同，因而被吸附的程度不同，从而以不同速度流动，使化合物得以分离。靛红与偶氮苯在极性上具有较大差异，从而可以使用极性适中的展开剂，通过柱层析将二者分离。
仪器与试剂 分析天平，tlc，锥形瓶，毛细管，层析柱，棉花，量筒，硅胶，蒸发皿，展缸；etoac, ch2cl2, 石油醚，靛红；请自带尺子（用于计算 rf 值） 颜老师在实验开始之前已经准备好的试剂：a. 偶氮苯的溶液（15 mg in 1ml etoh）；b.靛红的溶液（15 mg in 1ml ch2cl2）；c. 靛红与偶氮苯的均匀混合物（靛红 1.4 g + 偶氮苯 3.5 g）。
实验内容 a) 光照异构化 取 0.1 g 反式偶氮苯溶于 5 ml 无水乙醇中，将此溶液放于试管中，密封，置于可见光下二星期，以便与光照前的溶液进行对比。
b) 薄层层析 取管口平整的毛细管吸取光照后的偶氮苯溶液，在离薄层板边沿约 0.5 cm 的起点线上点样。再用另一毛细管吸取未经光照的反式偶氮苯溶液点样。待乙醇挥发后，将点好样品的薄层板放入内衬滤纸的展缸中。展缸内已放置展开剂（乙酸乙酯/石油醚=1/40）。薄层板的点样端在下方，浸入展开剂，展开剂不要没过起点线，也不要碰到样品点。待展开剂前沿上升到离板的上端约 1 cm 处时，取 出薄层板，立即用铅笔在展开剂上升的前沿处划一记号，置于空气中晾干。可观察到薄层板上经光照后的偶氮苯溶液点样处上端有两个黄色斑点（哪一个斑点是顺式的？哪一个斑点是反式的？）。计算异构体的 rf 值。
用上述相同的方法，采用 ethyl acetate : petroleum ether = 1:1 为展开剂，对靛红与偶氮苯的混合物进行 tlc，为下面的柱层析选择展开剂。
c) 柱层析 1．将层析柱固定在铁架台上，一定要保持柱子竖直。
2．将层析柱洗净后在柱底部放入一小团脱脂棉花。
3．在锥形瓶中称重 7g 硅胶（sio2），并用 ethyl acetate : petroleum ether (1:40)调匀。在层析柱的下方放置一个锥形瓶，以收集流下的液体。加入 少量洗脱剂于层析柱中，以润湿棉花，使其贴在柱子下端。
4．打开层析柱活塞，控制溶剂下流，将硅胶悬浊液沿柱子侧壁加入，并用 少量的溶剂洗去残余的硅胶，并加入柱中。用装有橡皮管或塞子由下向 上轻轻敲击柱子外壁，将气泡赶出，使硅胶填装均匀。并加压使硅胶紧 密，以获得较好的分离效果。轻轻敲击，使硅胶最上层成均匀平面，然 后用药匙沿柱子侧壁，轻轻地、慢慢地在硅胶表面覆盖一层海砂（注意：不要破坏硅胶的上平面）。关闭活塞，备用。
5．打开活塞，当溶剂液面降至海砂表面时，关闭活塞。用滴管沿柱子侧壁 加入靛红与偶氮苯混合物的溶液（称取 40 mg，置于 1.5ml 的塑料样品 管，加入 1 ml 二氯甲烷（ch2cl2），超声振荡使其溶解）。打开活塞， 使溶剂液面降至海砂表面，关闭活塞。再用少量的展开剂洗塑料样品管，加入层析谱中，并注意洗去粘附在柱壁上的液滴，打开活塞，流到液面，关闭活塞。重复上述操作，直到将所有化合物冲到硅胶里面。
6．沿侧壁加入大量的洗脱剂 ethyl acetate : petroleum ether (1:40)，打开活 塞，加压保持一定的流速，观察色带的形成和分离。
7．当第一个有色带到达柱底时，并且没有流出之前，关闭活塞，倒空锥形 瓶，打开活塞，收集全部色带。然后，改用 ethyl acetate : petroleum ether (1:1)作为洗脱剂。关闭活塞，换一个空的且干净的锥形瓶，打开活塞。
当第二个有色带到达柱底时，并且没有流出之前，关闭活塞，倒空锥形 瓶，打开活塞，收集全部色带。柱层析分离结束。
8．柱层析分离结束后，采用 tlc 对上述分离的两个溶液进行分析，总结分 离效果。同时，打开层析柱活塞，在加压下让展开剂流干，然后将硅胶 倒入指定的固体废物桶中。切勿倒入水槽或普通垃圾桶。
预习时的问题 1.在薄层层析实验中，为什么点样的样品斑点不可浸入展开剂的溶液中？为什么进行薄层层析时展缸要盖上盖？ 2.当用混合物进行薄层层析时，如何判断各组分的在薄层板上的位置？靛红与偶氮苯，哪一个的极性较强？为什么？ 3.柱层析时柱中若留有空气或者是填装不均匀，对分离效果有何影响？如何避免？ 4.偶氮苯和靛红物理化学性质？毒性？有什么应用？偶氮苯光照异构化的机理？why is trans-azobenzene more stable than cis-azobenzene? 其它阅读材料 1.光化学 由光的作用引起的化学反应近年来日益受到人们的重视，光合作用就是最重要的光化学反应。研究激发态分子化学行为的光化学反应已经成为有机化学的一个重要分支。光不仅可以引起多种多样的化学反应，合成各种前所未有的奇妙反应分子，而且与我们的日常生活及生命现象有着密切的联系。
2. 薄层色谱 1. 固定相的选择 氧化铝和硅胶是薄层层析色谱常用的固定相。氧化铝多用于分离碱性或中性有机物；而硅胶的吸附性源于表面的 si-oh 基，主要用于分离酸性、中性有机物质。
薄层色谱用的硅胶有薄层色谱用的硅胶有 60g、6ogf254、60h、60hf254 和60hf254+366 等类型，其中 g 表示含有13％硫酸钙（作为黏合剂）；h 表示不含硫酸钙；f254 表示含有 2％无机荧光物质，在 254 nm 的紫外光照射下发出绿色荧光。与硅胶相似，氧化铝也因含有黏合剂或荧光剂而分为氧化铝 h、氧化铝 g、 氧化铝 hf254 和氧化铝 gf254 等类...