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生物技术综合实验
甘薯γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因的克隆和原核表达
学生： 学号：
同实验者：
<研究背景>
谷胱甘肽(glutathione, GSH) GSH具有多种重要生理功能, 抗自由基和抗氧化应激作用, 保护细胞膜的完整性等。γ-GCS是植物细胞中GSH生物合成的限速酶, 可以调控GSH的生物合成量。GSH在生物体抵御冷害、干旱、重金属、真菌等胁迫过程中起着重要作用, 说明γ-GCS也与植物抗逆过程密切相关。
实验一 甘薯叶片RNA提取
一、实验目的 1. 了解真核生物RNA提取的原理；
2. 掌握Trizol提取的方法和步骤。
实验原理
Trizol?试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制源和外源RNase（RNA酶）。0.1%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。用这种方法得到的总 RNA中蛋白质和DNA污染很少。
实验材料
材料
甘薯（Ipomoea batatas Lam）叶片，品种为徐薯18
2. 试剂
① 无RNA酶灭菌水：加入0.01%的DEPC，处理过夜后高压灭菌；
② Trizol试剂；
③ 氯仿；
④ 异丙醇、75％乙醇；
⑤ TBE缓冲液；
⑥ 上样缓冲液（6×）
3. 仪器
高压灭菌锅、微量移液器、台式离心机、超净工作台、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、1.5mL塑料离心管、枪头和EP管架
实验方法
1. 将叶片取出放入研钵中，加入适量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100 mg植物叶片加入1 mL Trizol试剂，室温放置5 min，使样品充分裂解；
2. 每1 mL Trizol试剂加入200 μL氯仿，用手剧烈振荡混匀后室温放置3-5 min使其自然分相；
3. 4℃ 12,000 rpm 离心15 min，吸取上层水相转移到新管中；在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置15 min；
4. 4℃ 12,000 rpm 离心10 min，弃上清，RNA沉淀于管底；
RNA沉淀中加入1 mL 75%的乙醇（用RNase-free水配制），温和震荡离心管，悬浮沉淀； 4℃ 8,000 rpm离心2 min，弃上清；
室温放置10 min晾干沉淀；
沉淀中加入20μL RNase-free ddH2O，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70℃保存；
用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，用EB染色并照相。
实验结果
RNA提取结果
依照Trizol?试剂盒方法，提出的RNA较少，此部分未以图或数据显示。
2. RNA后电泳结果
如图1. 其中9a为本组实验结果。由图可知RNA条带非常模糊，拖尾现象严重，几乎无法分清具体条带，亮度较大。点样孔附近的红色部分为杂质，在提取过程中并未很好除去。
图1. RNA提取跑胶结果。其中1泳道为样品Marker，9a泳道为本小组RNA样品。与标准对照可见条带模糊，拖尾现象严重。
分析与讨论
1. RNA的提取
产量并不多，可能是因裂解样品不充分或RNA沉淀未完全溶解所致。在实验过程中，由于对操作时间的掌握不熟练、操作技巧不完善，留上清与弃上清时令RNA损失了部分，使最终RNA产量不理想。
2. RNA电泳结果
有EB存在时，电泳后28S rRNA和18S rRNA在紫外灯下应看得很清楚，另出现条由tRNA，5.8S rRNA和5S rRNA组成的较模糊、迁移较快的带。如果RNA没有降解，则28S rRNA的亮度应为18S rRNA的2倍，且这两条带都无弥散现象发生。由图1. 9a可知，RNA拖尾现象严重，说明RNA已大部分被降解；此外点样孔附近出现红色部分杂质，分析可能有并未除尽的蛋白质，同样影响RNA电泳结果。
在进行实验时，本小组成员未严格戴上口罩并勤换手套，这可能使外源RNAase进入样品，导致其降解严重。另外，提取出RNA后本小组未立即将样品放入-70℃保存，也为导致结果不理想的重要原因之一。在最初用氯仿萃取分层的过程中，由于水相吸取过多，掺杂入部分蛋白质杂质而未于后续纯化步骤除尽，RNA条带拖尾严重可能还受该蛋白质影响。
总结：
本次试验RNA提取非常失败，从跑胶结果可见其降解严重。虽然大实验无法避免试剂交叉污染的可能性，且电泳用胶的质量也会影响实验结果，但从图1. 2a，3a，2b等条带较为清晰的小组实验结果可知，琼脂糖凝胶质量以及试剂对结果干扰不大。那么本小组成员在提取过程中的操作一定出现了很大失误。首先口罩、手套应该严格按规定佩戴，提取过程对移液枪等仪器使用需谨慎仔细，尽量避免混入杂质。其次为排除部分杂质影响可对RNA样品用紫外线分光光度计测定吸光值检验，将有助于结果分析。最后，细节决定成败，我们应汲取教训避免接下来的实验出现类似问题。
实验二 第1链cDNA的合成和模板的验证
实验目的掌握第1链cDNA的合成方法和步骤
实验原理
真核生物基因多为断裂基因，编码区不连续，需经转录后加工才能成为成熟mRNA。以真核成熟mRNA为模板合成cDNA，进而获得有连续氨基酸编码的DNA序列，无需转录后加工，即可在原核细胞中表达。
真核生物的mRNA都有PolyA尾巴。引物：Oligo dT（12-18个T）。莫洛尼氏鼠白血病毒逆转录酶（M-MLV ）以单链RNA为模板，在引物的引发下合成与模板互补的DNA链（cDNA）。
mRNA 反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增称为RT-PCR，RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。
三、实验材料
1. 材料
徐薯18叶片RNA样品
2. 试剂
① dNTP mixture（10 mM each）；
② Oligo (dT) Primer (10 μM)；
③ Total RNA；
④ RNase free ddH2O；
⑤ M-MLV 反转录酶；
⑥ 5×First-strand Buffer；
⑦ 0.1 M DTT；
⑧ Ribonuclease Inhibitor (40 U/μL)
3. 仪器
10μL 和100μL 的移液枪、0.5mL的EP管、PCR仪等
实验方法
1. 在RNase free Microtube 管中配制下列混合液：
dNTP mixture（10 mM each） 1 μL
*Oligo (dT) Primer (10 μM) 4 μL
Total RNA 2 μL
RNase free ddH2O up to 12 μL
将混合物65 °C加热5 min，迅速在冰上冷却2 min，快速离心，然后加入下列成分：
5×First-strand Buffer 4 μL
0.1 M DTT 2 μL
Ribonuclease Inhibitor (40 U/μL) 1 μL
3. 将混合物轻轻混匀，37℃温浴2 min；
4. 加入M-MLV反转录酶（200U/μL）1 μL，用枪头轻轻吹打混匀；
5. 37℃温浴50 min；
6. 70 ℃加热15 min，使反转录酶失活，所得反转录产物可直接用于PCR反应。
附 反转录模板的看家基因的验证（β-actin）
引物
primers
sequences
size
IbActinF
IbActinR
5'-TTCCCCGGTATTGCGGATAGAATG-3'
5'-CGGACCGGACT CATCATACTCTG -3’
198bp
以第一链cDNA为模板，β-actin-F和β-actin-R为引物，使用Taq酶进行PCR。
表1 β-actin PCR 反应体系（25μL体系）
DNA模板
1μL(约50 ng)
10×PCR缓冲液(Mg2+ plus)
2.5μL
Mg2+
2.5μL
10 mol/L TPS -F
1 μL
10 mol/L TPS -R
1μL
2.5 mmol/L dNTP
2.5μL
Taq 酶
0.2 μL
灭菌去离子水
15.3 μL
合计
25 μL
* PCR反应条件
30个循环94℃ 2min
30个循环
95℃ 30sec
62℃ 30sec
68℃30sec
最后，1%琼脂糖凝胶上电泳检测扩增产物。
实验结果
β-actin验证
如图1. 其中编号1为Marker，3为本小组RNA样品β-actin验证结果。由图可知，使用RNA模板通过RT-PCR得到了长度为198bp类似条带，但因产物浓度较低，该条带不甚清晰，并有部分弥散现象发生。
图1. β-actin验证电泳结果。其中编号1为Marker，编号3为本小组RNA样品经RT-PCR在加入引物IbActinF 、IbActinR后扩增出的β-actin产物。
分析与讨论
1. RNA提取
因实验一本小组RNA提取失败，故此实验采用老师准备的RNA进行验证。
β-actin验证结果
如图1. 第3组为本小组验证结果。其中β-actin能被cDNA模板扩增出，但条带模糊并有拖尾现象出现。首先，因所得产物量较少，故电泳条带模糊，推测可能是在进行RT-PCR前，RNA有部分降解或于操作过程中损失部分所致。其次，本实验在对β-actin产物进行电泳后结果出现拖带，可能原因主要有：1）cDNA第一链产物的含量过高；2）DNase降解DNA产生的寡核苷酸有非特异性扩增；3）PCR反应中引物过多；4）循环次数过多；5）退火温度过低；6）Taq酶过多；7）Mg2+浓度不合适。综合本次试验分析，因实验条件已预先经过尝试，故导致拖带的最可能因素应为cDNA降解产生了寡核苷酸非特异性扩增片段。由于照片清晰度欠佳，非特异性扩增片段无法清晰显示，但若与图2. 进行对比则可发现第2组β-actin验证图出现了非特异性扩增片段。
图2. 第2组β-actin验证图。其中1为Marker，编号2、6可见清晰的两条带。
若要进行改进，则需尽量提取高质量RNA，防止其被DNA污染。另外进一步优化PCR反应条件也是必不可少的环节，提高退火温度可防止非特异性起始与延伸。
总结
本次实验虽只进行了模板验证，但让我们理解了RT-PCR的原理与其在真核生物基因克隆方面的运用。
整个过程中本小组成员较严格按照操作规进行，所得β-actin产物验证也较成功。今后实验需更加注意细节，不断完善自己的操作技巧，积累经验。
实验三 甘薯γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因克隆
实验目的1. 掌握PCR的方法和步骤。
实验原理
聚合酶链反应(PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；目的基因或某一DNA片段于数小时扩增至十万乃至百万倍。其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至一定温度后，使模板DNA双链解离，成为单链，与引物结合，为以下的反应作准备；
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。
③引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2-4分钟，2-3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
实验材料
材料
反转录产物DNA样品
2. 试剂
① dNTP mixture（10 mM each）；
② 第一cDNA；
③ β-actin的引物 （IbActinF和IbActinR ）；
④ γ-GCS的引物 （γ-GCS-F 和γ-GCS-R ）；
⑤ 10×PCR缓冲液(Mg2+ plus)；
⑥ Taq酶；
3. 仪器
PCR仪、2.5μL、10μL 和100μL 的移液枪、0.5mL的EP管、电泳仪。
实验方法
1. 扩增甘薯γ-GCS基因的引物
primers
sequences
Size
γ-GCS -F
γ-GCS -R
:5'-CGGGATCCATGGCGTTGATGTCCCAATCTG-3'
斜体： BamHI 酶切位点
:5'-CCGCTCGAGTCAATAGAGCAGCTCCTCAAATAC-3'
斜体： XHOI 酶切位点
1575bp
2. 甘薯γ-GCS基因的PCR扩增
2.1 甘薯γ-GCS基因的PCR扩增体系（表2）（25μL体系）
以第一链cDNA为模板， F和R为引物，使用Taq酶高保真酶进行PCR；
表2 γ-GCS PCR 反应体系
DNA模板
1μL(约50 ng)
10×PCR缓冲液(Mg2+ plus)
2.5μL
Mg2+
2.5μL
10 mol/L γ-GCS -F
1 μL
10 mol/L γ-GCS -R
1μL
2.5 mmol/L dNTP
2.5μL
Taq酶
0.5 μL
灭菌去离子水
14 μL
合计
25 μL
2.2. PCR反应条件
94℃4min
94℃ 40sec
65℃ 30sec 35个循环
72℃ 2min
1%琼脂糖凝胶上电泳检测扩增产物，并进行胶回收纯化；
3. 甘薯γ-GCS基因PCR产物胶回收——按照胶回收试剂盒的说明书进行：
1）将PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，5V/cm电泳1 h后，溴乙锭（或者Goldview）染色，在紫外灯下切下2500 bp左右大小片段的凝胶；
2）称凝胶重量，按1 g/mL体系加Binding buffer，在55°C水浴中孵5 min，直到凝胶完全溶解；
3）将凝胶溶液到DNA spin-column中，室温放置 2min，1,2000 rpm离心1 min，弃废液；
4）用700 μL washing buffer洗涤柱子，1,2000 rpm离心1 min；
5）弃废液后再1,2000 rpm离心2min，以除去残存的washing buffer；
6）把column放到另一干净的1.5 mL离心管，加50μL elution buffer，室温放置2 min后，1,2000 rpm离心1 min以洗脱DNA；
4. pET-32a质粒的BamHI和 XHOI双酶切
酶切体系（10μL体系）：
buffer (BamHI) 1 μL
BamHI 0.3μL
XhoI 0.6μL
质粒 8.1μL
酶切反应：37℃水浴中孵化1h；
5.甘薯γ-GCS合成酶基因胶回收产物的BamHI和 XHOI双酶切
酶切体系（10μL体系）：
buffer (BamHI) 1 μL
BamHI 0.3μL
XhoI 0.6μL
PCR胶回收产物 8.1μL
酶切反应：37℃水浴中孵化 1h。
实验结果
甘薯γ-GCS基因PCR电泳图
如图1. 其中1为Marker（最大片段2kb），4a为本小组甘薯γ-GCS基因PCR扩增产物。由图可知该组各条带均较明亮清晰，模板经引物R、F扩增后得大小在1575bp左右的目标产物，即约1.5kb，跟Marker对比并进行了标注（图1. 红色框）。另图中除标注部分以外还出现多余条带，但因后续实验采取割胶回收方式获得γ-GCS基因片段，故其余片段不会对实验结果造成影响。
γ-GCS基因1.5kb左右右
γ-GCS基因1.5kb左右右
图1. 甘薯γ-GCS基因PCR电泳图。其中编号1为Marker，4a为本小组γ-GCS基因电泳结果。红框已圈出γ-GCS所在条带位置，大小在1.5kb左右。
分析与讨论
1. 甘薯γ-GCS基因PCR电泳结果
由图1. 4a可知，本次甘薯γ-GCS基因PCR较为成功。该产物条带比较明亮，边缘整齐，但除目的条带外仍扩增出了不少多余条带，说明DNA模板存在小部分降解。实验过程中应尽量避免DNAase污染以及机械剪切力损伤样品，而操作时更应注意加样时间，经分析电泳结果出现非目的基因小片段可能是加样时间过长引起的。
另外，本实验在电泳时还可设计阴性对照（灭菌去离子水、缓冲液），以使结果更加完善。
2. 胶回收与双酶切
由于严格按照实验步骤进行，胶回收与双酶切均完成较好。此处未以数据、图片表示。
总结
本次实验包括PCR γ-GCS基因片段（目的基因）并作电泳检测、胶回收纯化目的基因以及BamHI、XhoI双酶切质粒与目的基因三个步骤。由实验结果可知目的基因扩增较为成功，虽有多余杂质出现但条带仍然清晰、整齐。胶回收时，溶液放置2min是为使buffer与产物溶液混合均匀并稳定以减少杂质影响，最后双酶切的孵化时间与温度是关键，故于操作过程中我们应注重细节，多体会才能理解、掌握成功要领。
实验四 原核表达质粒构建
一、实验目的1. 掌握连接和转化步骤。
实验原理
DNA体外连接即在一定条件下，由DNA连接酶催化两个双链DNA片段相邻5’端磷酸、3’端羟基间形成磷酸二酯键的过程，DNA分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。连接反应成功与否，最后的检测要转化宿主菌、阳性克隆的筛选来确定。质粒转化不同细菌有不同的转化效率，转化效率的高低与实验的成败直接相关，通常转化效率可达105-107转化子/μg DNA，获得高转化效率的关键是感受态细菌的制备。
体外通过基因工程手段所构建含目的基因的重组质粒，通过转化和筛选技术，可获得含重组子的阳性克隆。在此阳性克隆中，DNA可在生物体系大量扩增、繁殖、保存及表达目的基因产物，这是PCR体外扩增DNA所不能替代的。配合DNA重组技术所获得的阳性菌株已广泛应用于科研，医药生产和生物发酵等领域。
实验材料
材料
甘薯γ-GCS基因酶切片段、载体片段
2. 试剂
① 10×T4 DNA ligase buffer；
② T4 DNA ligase；
③ ddH2O；
④ SOC培养液；
⑤ buffer BamHI；
= 6 \* GB3 ⑥ DMSO；
= 7 \* GB3 ⑦ TFB溶液(100 mmol/L KCl, 45 mmol/L MnCl2，10 mmol/L CaCl2,10 mmol/L K-MES pH6.2)；
= 8 \* GB3 ⑧ β-巯基乙醇；
仪器：
10μL 和200μL 移液枪、1.5mL的EP管、离心机、培养皿、电泳仪、37 ℃培养箱、4 ℃冷藏室
实验方法
1. 甘薯γ-GCS基因酶切产物与pET-32a酶切产物的连接
连接体系（10μL体系）：
10×T4 DNA ligase buffer 1μL
载体片段 4μL
PCR酶切片段 3μL
T4 DNA ligase 0.5μL
ddH2O 1.5μL
连接条件：16℃连接过夜；
2. 大肠杆菌感受态细胞的制备
1）接种JM109于2 mL SOB培养基中，37℃振荡培养过夜；
2） 取0.5 mL菌液转种于50 mL SOB培养基中，37℃振荡培养2-2.5 h (OD550值约为0.4-0.5)后，冰浴10 min，4, 000 r/min离心5 min，弃上清液；
3）加入17mL预冷的TFB溶液(100 mmol/L KCl, 45 mmol/L MnCl2，10 mmol/L CaCl2,10 mmol/L K-MES pH6.2)洗涤菌体1次，离心收集菌体；
4） 加入4 mL TFB制成悬液，冰浴10 min，加入140μL二甲基亚砜(DMSO)，冰浴上轻轻转动10 min，加入140 μL β-巯基乙醇，于冰浴上轻轻转动10 min，再加入140 μL DMSO，轻轻混匀后在冰浴上静置5 min，即得感受态细胞；
3. 连接产物的转化
1）在预冷的EP管中加入1-10 μL质粒DNA，加入200 μL上述感受态细胞，混匀后在冰浴上静置30 min；
2）42℃水浴热冲击30 s，冰浴上放置10 min，加入0.8 mL SOC培养液。置于37 ℃振荡培养1 h；
3）取0.1 mL涂布于加有抗生素的LB培养基平板上，37 ℃培养过夜。若转化子很少，特别是连接DNA的转化，可将转化细胞离心3 min (4,000 r/min)，弃上清液，把所有的菌体涂布在含相应抗生素的平板上；
4）正放于37℃培养箱约1h使接种物完全被吸收，然后将平板倒置于37℃培养箱中培养，12～16h后，将平板移入4℃(冰箱冷藏室)放置数小时；
4. 质粒的小量提取：采用试剂盒（E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit I）方法进行提取
4.1 实验前准备：
1）使用前，将RNase A全部加入Solution I中并于4度保存；
2）按下表用无水乙醇稀释DNA Wash Buffer，并于室温保存；
D6942-00, 3：加入ml无水乙醇
D6942-01,D6943-01：加入80ml无水乙醇
D6842-02,D6943-02：每瓶中加入80ml无水乙醇
4.2 离心操作方案：
1）将带有质粒的E.coli 接种于5ml LB/抗生素培养液中，37°C搖床培养12~16 h；
2）取1.0~5.0ml的菌液，室温下10,000xg离心1min收集细菌；
3）倒弃培养基。加入250ul Solution I/RNaseA混和液，漩涡振荡使细胞完全悬浮；
4）往重悬混和液中加入250ul Solution II，轻轻颠倒混匀4-6 次。此操作避免剧烈混匀裂解液且裂解反应不要超过5 min；
5）加入350ul Solution III，温和颠倒数次至形成白色絮狀沉淀；
6）室温下，≥10, 000xg离心10min；
7）转移上清液至套有2ml收集管的HiBind DNA结合柱中，室温下10,000xg离心1 min，倒去收集管中的滤液；
8）把柱子重新装回收集管，加入500ul HB Buffer，按上述条件离心，弃去滤液；
9）把柱子重新装回收集管，加入700ul DNA Wash Buffer，按上述条件离心，弃去滤液。注浓缩的DNA Wash Buffer在使用之前必须按标签的提示用无水乙醇稀释；
10）弃去滤液，重复第9步骤一次；
11）弃去滤液，把柱子重新装回收集管， 10,000xg离心空柱2min以甩干柱子基质。注不要忽略此步――这对去除柱子中残留的乙醇至关重要；
12）把柱子装在干净的1.5ml离心管上，加入30-50ul Elution Buffer(10mM Tris-HCl, PH8.5)或无菌水到柱子基质中，静置1- 2min，10,000xg离心1min洗脱出DNA；
5. 重组子的PCR鉴定。
实验结果：
重组质粒粗提检测
如图1. 粗提后均出现了大小不同的质粒，较小者应为pET-32a质粒载体以及E.coli原有质粒，较大者为重组质粒，而重组阳性质粒则需后续实验鉴定。其中4a为本小组提取结果，由于拍照条件不佳，最大条带较模糊（图中红色方框圈出），但仍能辨别出3条带。E.coli原有质粒与pET-32a质粒空载体条带最亮，而成功转化的重组质粒条带相对暗淡，很难分辨清楚。
图1. 重组质粒粗提电泳检测图。其中4a为本小组样品条带，红框圈出部分为重组质粒，量较少。
重组质粒PCR检测
如图2. 所示，2b即本小组实验条带，9为Marker条带（同实验三）。以大质粒为模板，γ-GCS -F、R为引物进行PCR，得1.5kb左右条带十分清晰，已由图中标出。
图2. 重组质粒PCR电泳检测图。其中9为Marker条带，2b由红箭头所指为本小组重组质粒PCR条带，大小在1.5kb左右。
分析与讨论
1. 重组质粒粗提电泳结果
如图1. 可大致观察到重组质粒的形成，但由于产量较少，重组质粒的转化率不好，分析可能是在进行目的基因与载体连接时成功率较低所致。另因图中无Marker显示，对重组质粒的条带确认增加了难度，单一完整pET-32a质粒与E. Coli受体菌自身已携带质粒的电泳条带可起辅助分析作用，以使电泳结果更完整。
2. 重组质粒PCR电泳结果
图2. 2b条带较为清晰整齐，说明有阳性重组质粒形成，转化成功。但条带稍有拖尾现象产生，分析可能是由PCR过程中升温所导致的质粒不规则变性、断裂而引起，并形成了些大小不一的片段，电泳时呈弥散状分布于主条带后，分子量较大。
总结
本次试验过程中，因酶切鉴定结果不理想而改用PCR鉴定。对质粒进行提取时的机械力损伤、PCR升温步骤均可导致质粒片段受损，这些失误在操作或实验设计方面都需尽量避免，虽然重组质粒量较少但其能成功转化受体菌，这也为随后IPTG诱导目的基因表达γ-GCS产物打下了一定基础。多做、多思考、多总结，才能于每个环节中学习到更多知识。
实验五 甘薯γ-GCS基因的原核表达
一、实验目的1. 使用IPTG诱导外源基因表达，了解筛选原理；
2. 掌握SDS检测表达蛋白质的原理与方法。
二、实验原理
1. E.coli表达系统
E.coli是重要的原核表达体系。在重组基因转化入E.coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS以检测表达蛋白质。本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。
lacI是大肠杆菌中lac 操纵子（Operon）的调节基因，它所表达的阻遏蛋白是lac 操纵基因（Operator）的抑制因子，抑制转录启动。当有乳糖存在时，这种阻遏蛋白能与过量的乳糖结合而失去对操纵基因的抑制，使lac 操纵子上的结构基因lacZ（β-半乳糖苷酶)、lacY（透性酶)、lacA(乙酰基转移酶）得以正常表达，启动转录。IPTG（异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷) 作为乳糖的类似物与lacI阻遏蛋白结合而使操纵基因不被抑制，因此IPTG经常作为lac操纵子的诱导剂运用于筛选。
2. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）
使用含有十二烷基硫酸钠（ SDS）和还原剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸3-5分钟），通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。
SDS是变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用。巯基乙醇打开二硫键以使蛋白质分子处于伸展状态。蛋白质在电场中的迁移率取决于它所带的净电荷以及分子大小和形状等因素。加入SDS（十二烷基磺酸钠）和少量巯基乙醇，则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量，而与原来所带电荷、分子形状无关。电泳过程中分子迁移的规律为：小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。
实验材料
材料
已得甘薯γ-GCS基因阳性重组子
2. 试剂
2.1 诱导表达
① LB培养基；
② SOC培养液；
③ 50 μg/mL Amp；
④ IPTG；
2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
① 30%丙烯酰胺凝胶贮液： 丙烯酰胺30 g， N, N-亚甲双丙烯酰胺 0.8 g；
② 4×Tris·Cl/SDS pH 8.8：18.2 g Tris碱溶解于40 mL水中，用1 mol/L的盐酸调pH为8.8后，定容到100 mL，再加0.4 g SDS；
③ 4×Tris·Cl/SDS pH 6.8：6.05 g Tris碱溶解于40 mL水中，用1 mol/L的盐酸调pH为6.8后，定容到100 mL，再加0.4 g SDS；
④ 样品缓冲液：1 mL 4×Tris·Cl/SDS(pH 6.8)，1 g SDS，2 mL β-巯基乙醇，1 mL 0.1%溴酚兰，5 mL 甘油，加蒸馏水定容到50 mL；
⑤ 电极缓冲液：0.6 g Tris碱，2.88 g甘氨酸，0.1 g SDS；
⑥ 固定液：50%甲醇，10%冰醋酸；
= 7 \* GB3 ⑦ 染色液：0.05%(w/v)考马斯亮蓝R-250，50%甲醇，10%冰醋酸；
= 8 \* GB3 ⑧ 脱色液：7%冰醋酸，5%甲醇；
= 9 \* GB3 ⑨ SDSLoading Buffer；
仪器
电泳仪、染液缸
实验方法
E. coli BL21 (DE3) 感受态的制备；
重组子转化BL21；
原核表达
1）挑取上述方法得到的单菌落于2 mL LB液体培养基(氨苄青霉素50 μg/mL)中。同时，BL21作为对照（不加抗生素）。于37℃培养至OD600为0.5；
2）取20 μL菌液接种2 mL LB液体培养基(氨苄青霉素50 μg/mL), 37℃培养OD600为0.5；
3）加入IPTG最终浓度梯度2mM ，18℃诱导表达16h；
4）诱导结束后，用超声波破碎细胞；
5）1mL菌液加入100μL的SDSLoading Buffer，100℃煮沸5min；
6）取30μL上清样品点样，分析SDS胶，观察表达结果；
4. 按下表配方制备SDS凝胶，加样。先10 mA恒流电泳至分离胶，再调为15 mA恒流到电泳结束；
组分
12%分离胶(mL)
3.9%浓缩胶(mL)
丙烯酰胺贮液
4×Tris·Cl/SDS, pH 8.8
4×Tris·Cl/SDS, pH 6.8
ddH2O
10%过硫酸铵
TEMED
6.00
3.75
--
5.25
0.05
0.01
0.65
--
1.25
3.05
0.025
0.005
5. 考马斯亮蓝染色
将聚丙烯酰胺凝胶用固定液固定2 h；
倾去固定液，以考马斯亮蓝染色液染色4 h；
倾去染色液，加入脱色液，缓慢摇动脱色。中间换脱色液，脱色到获得蓝色条带及干净的背景为宜。
实验结果
1. 重组子转化的E. coli BL21 (DE3) 筛选鉴定
通过两轮氨苄青霉素（50 μg/mL）筛选成功转化重组质粒的受体菌BL21后，37℃培养至OD600为0.5，此时培养皿中呈大量灰白色带菌丝菌落，此处未用图片记录；随后重新转化摇菌，培养皿出现正常BL21菌落。
2. 诱导表达产物电泳检测
如图1. 其中编号1为Marker，2b为本实验小组电泳条带，红色方框圈出部分为γ-GCS蛋白，可见十分明亮的单一条带，但边缘处稍显弥散不够整齐。另亮条带下方仍有少许颜色较浅的杂质带，拖尾现象明显。
图1. γ-GCS产物电泳图。1为Marker，2b为本小组电泳带，红色方框圈出 γ-GCS产物条带，含量较高。
另外，针对图1.对照组方面的缺陷，本实验还增加了如图2. 改进。其中，红色方框圈出部分为IPTG诱导γ-gcs表达产物的电泳条带，9泳道加入了有IPTG诱导的pET32质粒，用以确定空质粒不表达γ-GCS，且条带较深处位于下方，说明多含小分子蛋白。8、9泳道均以单一变量原则设置为空白对照，若缺少IPTG的强诱导作用，目标蛋白γ-GCS的产量也会大大减少。
1 2 3 4 5 6 7 8 9
图2：1、2、3、4、5、6、7道：IPTG诱导的γ-GCS表达，已由红色方框圈出；8道：未加入IPTG诱导的γ-GCS表达；9道：pET32质粒加入IPTG诱导表达。
分析与讨论
1. 重组子转化的筛选结果
因第一次涂布后出现大量灰白色带菌丝菌落，而一般E. Coli菌落应呈圆形、边缘整齐且表面光滑的半透明小凸起，由此推测可能是培养基被霉菌污染所致，需重新进行涂布培养，PH达7.4最佳。
2. γ-GCS电泳检测结果
如图1. 最明亮的条带应该是IPTG诱导目的基因所表达的产物γ-GCS，由于进行阳性重组质粒筛选后BL21携带大量目的基因γ-gcs，在IPTG诱导的情况下lac强启动子因阻遏蛋白失活而启动转录，位于其下游的γ-gcs得以表达，从图1. 2b可知该实验较为成功。另外，杂质蛋白的出现经分析可能与BL21表达源性蛋白有关，也可能是LB培养基里的蛋白质有少许混入样品所致，但由于目的基因表达量较高，杂质对其影响不大。
若需要更充分证明产物γ-GCS，可在pET-32a XhoI 酶切位点后加入6个His标签，进一步通过His特异性抗体做Western杂交验证产物的表达，此方法对目的基因表达量很少时较适用。
总结
整个实验到此基本完结，从提取RNA、进行反转录得cDNA并验证、又由cDNA扩增出γ-gcs、连接质粒pET-32a后转入BL21诱导其表达，到最终得产物γ-GCS，共分五个实验，将真核生物基因克隆及表达产物的全过程分步介绍，且使我们对之有了具体理解和体会。但最后因失误忘记录蛋白质Marker、γ-GCS的分子量大小，而若按AA平均分子量128进行计算粗略估计γ-GCS有60kD，若知道Marker分子量分布则能使分析结果更加完整，故今后实验需善始善终，在注意细节的同时则更要养成持之以恒的良好习惯。